Pacific Biosciences公司的技術PacBio的測序原理

Pacific Biosciences公司的技術PacBio的測序原理歡迊來到【陳巍學基因】我們這個節目，主要是給大家介紹 基因組學和臨床分子診斷的最新技術本期節目，要給大家介紹一下Pacific Biosciences公司的簡稱叫 「PacBio」PacBio是目前為止，讀長最長的下一代
測序技術公司相比於Illumina和Ion Torrent的幾百個 鹼基的讀長，有着明顯的優勢今天，我們就給大家介紹一下它的技術PacBio的測序原理，和別的高通量 測序的原理，基本上也是一樣的也是邊合成，邊測序首先，這個
聚合酶是 固定在 測序小孔的 玻璃底板上這個聚合酶
又和DNA模板、 測序引物 結合在一起然後加入 帶四色熒光
的dNTP底物這些dNTP都在其磷酸基團上被標上了熒光基團四種鹼基，各標一種顏色當一種與正要合成的鹼基一致的dNTP被酶抓住的時侯酶就會長時間地抓住這個dNTP不讓這個dNTP漂走這時侯，激發光就從小孔的底部照進來打在這個被抓住的dNTP上就會在較長時間內發出熒光儀器根據拍到的熒光的顏色就可以判斷，這個鹼基是哪種鹼基一個循環的聚合反應發生完畢之後焦磷酸基團就從原來的dNTP上掉下來因為這個熒光基團是連到焦磷酸上的所以，這個熒光基團就一起掉下來了在溶液中就會漂走接下來，進行第2輪、第3輪……的循環一直進行下去一張晶片上有幾萬個孔同時進行測序這樣，一次就可以得到幾億個鹼基的 序列接下來，分幾個要點，來說明這個 測序的過程和Illumina一樣PacBio也採用了4色熒光基團來標記dNTP但是PacBio的標記和Illumina的標記有所不同PacBio的熒光基團是標在磷酸基團的末端這樣標記的好處，是當一個循環的 聚合反應完成的時侯dNTP上的那2個磷酸（基團）有掉下來連在這個磷酸上的熒光基團也一塊兒掉下來它掉下來之後，就在溶液中漂走不會影響接下來的測序的過程然後，我們說一下這個測序小孔的設計小孔的
直徑很小光只能在 小孔中傳輸 很短的距離這個特點對 PacBio的
測序很重要因為酶是被 固定在玻璃 底板上的所以，只有 互補的dNTP
被酶抓到的 時侯這個dNTP才會 較長時間地 停留在離玻璃
底板很近的 位置也只有這樣， 才會被激發 光照到並且發出它
患上EGFR基因突變引發的EGFR肺癌患者都是很痛苦的，甚至是失去了生活的希望，其實患者不要太悲觀，只要選對藥物，徹底治癒癌症是完全有可能的。
的熒光其它游離的dNTP只會非常短暫地進入 小孔又很快漂走所以，這些游離dNTP的噪音，就被抑制 在很低的水平接下來，我們說一下PacBio的建庫PacBio的建庫是比較特別的這種啞鈴形的文庫有個好處這對發揮PacBio長讀長的優勢，是非常 有益處的接下來，我們要說一下PacBio測序長度
優勢的來源這個來源是它測的是個單個的分子相比之下，Illumina或者Ion Torrent 測的都是一簇分子或者說，測的都是一大堆分子當它測一大堆分子的時侯每個循環，多多少少，總有一些分子落後也多多少少，有些分子超前這些落後、或者超前的分子，每個循環 就會給出噪音而且，隨着循環次數越來越多落後、和超前的分子也會越來越多達到一定程度的時侯，噪音就會很大大到會掩蓋掉信號當噪音大到掩蓋掉信號的時侯實際上，這時侯，測序就測不準
了相比之下，PacBio它只有一個分子所以，它不存在同步問題這就讓它可以測到幾千、甚至上萬個BP， 也可以達成接下來，我們要說一下PacBio測序的 缺點也就是說，它每讀8個鹼基，就有一個 是讀錯的也就是說，它會多讀一個鹼基好在，它的這種錯誤是隨機的也就是說，你在這個地方再讀一遍，它
不一定會發生同樣的錯誤那麼，對於同一個序列，多測幾遍之後這些偶然誤差，可以被校正過來接下來，我們說一下限制PacBio讀長的 因素測序過程中是用激光照射來發出熒光的所以，當強光長時間照射DNA鏈的時侯DNA鏈就有可能被照斷掉出現缺口當酶讀到這個缺口的時侯酶就從模板鏈上掉下來這時侯，測序就終止了這是第一種可能這時侯，測序也會終止要做片段長度大於20~30個K的文庫是有相當大的困難的所以，文庫本身的質量，也限制了PacBio 的讀長在高通量測序當中測序的通量，是一個很重要的技術指標在PacBio測序中，晶片上的小孔數是 第一個絕對、限制性的因素但這15萬個小孔中，並不是每一個都能
產生有效數據的這裏，我們要說一下，測序複合物和 玻璃底板的結合方式因為是隨機地鋪灑撒進去的所以，有多少個小孔裏面正好有一個 測序複合物最理想的情況下空的這些小孔，因為接下來沒有聚合 反應發生也沒有信號那當然是廢掉了所以，這些孔實際上也是沒用的它產生的數據，在接下來的數據分析
當中，是會被去掉的PacBio在測序當中，可以直接測到鹼基 的被修飾狀態這樣就可以判斷，這個位置上DNA被甲基化了PacBio測序，還有另外一個好處就是它GC bias很小什麼叫GC bias呢？
就是我們知道所有的PCR的過程如果模板裏面G、C（鹼基）的含量比較高PCR的效率就比較低反之，A、T（鹼基）的比例比較，它PCR 的效率比較高傳統的建庫當中，都有大量的PCR的 過程它導致的一個結果就是G、C（鹼基）含量高的那些片段它讀到的Reads數，就會比較少PacBio它的好處高GC的片段有和低GC的片段差不多的概率被讀到高通量測序的另外一個指標就是測序的 速度PacBio的速度取決於酶反應的速度到3萬多個鹼基之後，基本上，還在
繼續在讀的Reads，已經幾乎沒有了所以，3個小時之後，測序基本就完成了一個Run讀三個小時所以，PacBio是一個非常快的測序方式謝謝大家觀看本期節目

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