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單細胞測序自從二代測序技術出現大家好，歡迊來到【陳巍學基因】我們這個節目，主要是給大家介紹 基因組學，和臨床分子診斷的最新技術進展今天，和大家談一下單細胞測序自從二代測序技術出現把一次實驗測許多條DNA序列的這個難題 解決之後科學家就在想，如何能夠從極少的樣本中， 一次把一個人的全基因組給測出來最極限的情況，就是樣本量就是少到一個
細胞，就要測出整個基因組的序列信息要實現從一個細胞樣本測出全基因組的 DNA序列，至少要克服以下3個難題第1個，就是如何實現均勻擴增也就是說，用傳統的隨機引物PCR的方法來 擴增那麼不同擴增片段的擴增效率多少會有 一些差異這些擴增效率的差異會隨着擴增循環數的
增加，呈現出指數放大的效果其結果就是會發生嚴重的覆蓋不均一極少數區段的DNA被大量擴增，測序後 它深度非常深但在大多數區段只有很低的覆蓋，甚至 沒有覆蓋那麼我們就無法有效地判斷那些低 擴增效率區段的基因序列的情況那麼它的第2個難題，就是
全基因組覆蓋 問題常規的、用大量DNA進行建庫的方法因為打斷、補平、加A、加接頭等一長串 的操作每一步都會有DNA片段的損失結果就是初始DNA中很大一部分會被 浪費掉，而沒有形成有效的文庫分子在單細胞測序中，丟失大部分的起始DNA，
是不可接受的單細胞測序要求幾乎所有的原始基因組 片段都得到擴增並且在後續的測序過程中被測序測到這就要求幾乎所有的片段，都會被得到擴增而不只是少數片段得到有效擴增第3個難題，是這種方法要有 較高的 擴增效率建好的文庫，在HiSeq測序儀上機的時侯大約每上機2萬個文庫分子，只有1個
文庫分子，是能夠在測序的Flowcell表面 生成簇，並且被測序測到的剩下的大多數文庫分子，在上機的時侯是 被水沖走的所以，單細胞基因組擴增的方法，還要有 較高的擴增效率至少要有上萬倍到幾十萬倍的擴增效率才能保證在全基因組測序的時侯，大部分
患上EGFR基因突變引發的EGFR肺癌患者都是很痛苦的，甚至是失去了生活的希望，其實患者不要太悲觀，只要選對藥物，徹底治癒癌症是完全有可能的。
的片段都被測序測到為了解決上述的難題，科學家想了許多 的辦法到目前為止，大家比較認可的方法有兩種第一種是MALBAC方法第二種是MDA方法我們先來說這個MALBAC方法它的全稱是：Multiple Annealing and
Looping-Based Amplification Cycles是謝曉亮教授發明的方法這張圖是 MALBAC方法
的示意圖這個黑色的線條，就是基因組模板DNA這些紅顏色的線條就是擴增引物擴增引物的5』端有27個鹼基的通用序列這些通用序列會作為未來的PCR通用擴增 引物的結合序列擴增引物的3』端有8個隨機序列的鹼基這8個鹼基可以隨機地雜交到基因組DNA的 互補序列上這些灰色的橢園是Phi 29
DNA聚合酶Phi 29 DNA聚合酶有一個特點，它不僅 可以生成新的DNA鏈它還能把之前已經合成好的DNA鏈給解鏈開再形成自己的新鏈這個特點能夠把每個循環所能合成的DNA
新鏈的數量提高几倍、甚至幾十倍、上百倍接下來，就是做5個MALBAC循環請注意，這裏每個循環的最後一步是58度 退火我們後面要詳細解釋這一步58度退火的作用第一個循環下來，得到的是一批5』端有 通用擴增序列的DNA片段在第二個循環完成後，所產生的擴增產物中大部分是5』端有通用序列而3』端，有與通用序列互補的序列的 這些片段圖中的這4個步驟，一共重複5次這樣做的巧妙之處，就是要解決我們剛才
所說的3個難題第一、是要均勻擴增第二、是要全基因組覆蓋第三、是要有高的擴增效率那麼，我們先來看這個線性擴增剛才，這個MALBAC方法的巧妙之處，就是 在每個循環的最後，加了一步58度退火這一退火過程，它讓完整擴增的產物，它 的兩端發生鏈內雜交這樣，3』端的序列就不能與新的、游離的 引物發生雜交這也就不會引新的、發起始於3』端的擴增這樣，就避免了完整擴整的產物的自我
指數擴增現在，還是8個隨機序列的引物在模板上 隨機地找結合位置所有的位點都有一樣的機會被擴增那麼，這樣實際得到的產物分3種第1種，就是m* n 個「完整擴增產物」
2這是最主要的產物這裏「m」就是循環的次數「n」是一個循環中，有多少個擴增 引物可以粘到一個模板上第2種擴增產物，就是(m+1)* n個 「半擴增產物」第3種DNA，就是那個原始的DNA模板這裏完整產物的數量是「m*n
」 2也就是說，擴增產物（的數量）與 擴增的循環次數「m」成正比而不是與m 成正比
2更不是與2 成正比 m這也就是達到了，我們想要的 「線性擴增」的目的也就是說擴增產物（的數量）與擴增
的次數成線性關係這就達成了我們單細胞測序當中第1個 要求「線性擴增」第2個要解決的難題，就是「全基因組 覆蓋」這裏，是利用Phi 29聚合酶的能一次在
模板上聚合出多個新鏈的功能來達到 這個目的在5輪的擴增之後，每個模板都會有5*n 個擴增片段 2這樣，就可以保證建庫時大多數的
基因組區域可以被建成文庫最後，可以被（測序）測到第3個要解決的問題「高效率擴增」還是利用了這個Phi 29酶的一次得到 多個擴增片段的這個效果，來達成的上面所說的，就是MALBAC單細胞擴增 技術的基本原理、和它的巧妙之處目前市場上還有一種單細胞的擴增技術，
叫MDA擴增技術它的全稱是Multiple Displacement AmplificationMDA方法的技術核心是用Phi 29
DNA 聚合酶來進行直接的擴增Phi 29酶的特點是，它可以把雙鏈DNA 進行解鏈然後，在常溫條件下，就把原始模板
進行大量擴增把MDA和MALBAC兩種方法進行比較MDA的優勢在於，它的擴增效率更高並且，實驗方法更簡單MALBAC方法的特點，在於它的擴增 均一性更好但是，它得到的擴增DNA量相對較少或者說，它的擴增效率相對比較低這張圖是：大量細胞測序、MDA方法測序、 MALBAC方法測序，這三種測序結果的 Lorenz曲線Lorenz曲線是越接近於對角線，則覆蓋
越均一從圖中，我們可以看出大量細胞測序， 它的均一性是最好的用MALBAC方法測序，它的均一性比 大量細胞測序的均一性要差一些但是要比MDA的方法的均一度要好這張圖是用三種方法來測腫瘤細胞中的 拷貝數變異其中橫軸是染色體的序列縱軸是測序的覆蓋深度可以明顯地看到，在大量細胞測序的
結果中可以非常直觀地看到拷貝數變異的情況而用MALBAC的方法，也還是能夠比較 清楚地看到拷貝數變異但是，它沒有大量細胞測序的結果那麼 清楚而用MDA的方法來看拷貝數變異，則 不是那麼容易看清楚單細胞測序，有着廣泛的應用前景目前最主要2個應用：1個是在胚胎植入
前進行基因拷貝數變異檢測第2個，是進行腫瘤的染色體變異研究在這裏我們介紹一下，單細胞測序在 胚胎植入前檢測中的應用在有習慣性流產的夫婦當中，最常見的 病因就是染色體的平衡易位所謂染色體平衡易位，也就是A染色體 的一段移到了B染色體上如果夫妻一方有染色體平衡易位那麼這對夫婦的受精卵中，每4個
受精卵，可能只有1個是正常的剩下3個（不正常的受精卵），很可能 會流產要把這一個正常的受精卵挑出來，目前 最有效的解決手段是做受精卵植入前 檢測那麼具體的操作方法，就是先做人工
受精在受精卵發育到8個細胞的時侯通過顯微操作，抓一個細胞出來進行 測序在這個測序過程當中，就要用到MDA方法 或MALBAC方法進行擴增、建庫、測序然後測序完成之後，挑出那個好的 受精卵，植回到母親的子宮中去長成一個正常的新生兒這個，就是受精卵植入前基因檢測這項技術，是對生殖健康有很大幫助
的一項新技術以上，是本期節目的全部內容謝謝您的收看，我們下期節目再見！
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