談談單細胞mRNA 測序技術大家好，歡迊來到【陳巍學基因】我們這個節目，主要是給大家介紹基因 組學，和臨床分子診斷的最新技術進展今天，想和大家談一下單細胞mRNA 測序技術單細胞mRNA測序一直是科學家關注的 一個熱點目前市場主要有2種建庫方法分別是Clontech公司推出的SMART法
和EpiCentre公司推出的TargetAmp方法要實現單細胞mRNA測序，需要解決2個 難題第一個難題就是一個人類細胞當中， 它的總RNA量大約只有10pg左右 （1pg=10
g） -12其中的mRNA的量大約只有0.2個pg要把那麼少的mRNA轉變成約零點幾個μg （1μg=10 g）以上的核酸文庫
-6這意味着核酸的擴增量要達到幾百萬倍 以上如何能在這個核酸擴增過程當中不引入 太多的PCR偏差，就一直是個大問題所謂PCR偏差就是在PCR擴增過程當中，某些片段被 大量擴增而大部分片段被擴增的量很少甚至根本就沒有被擴增結果就導致高通量測序，只能測到
這所有樣本當中很少一部分的片段序列PCR偏差會隨着PCR循環的次數的增多而 指數放大那麼，在這種情況下，一方面要把核酸 擴增幾百萬倍，甚至更多的倍數另一方面，又想得到均一覆蓋的文庫這就是單細胞mRNA建庫當中，所要解決 的第一個大難題第二個難題是如何能儘可能高效地
患上[color=#小地球]EGFR基因突變引發的EGFR肺癌患者都是很痛苦的，甚至是失去了生活的希望，其實患者不要太悲觀，只要選對藥物，徹底治癒癌症是完全有可能的。
得到「mRNA」的文庫而不是含了大量「rRNA」序列的文庫因為rRNA在總RNA當中佔了95%，甚至 更高的比例而mRNA在總RNA當中只佔2~3%的比例如果不加區分地進行逆轉錄再擴增、建庫很可能測序得到的絕大部分序列都是 rRNA的序列但是 rRNA序列不能給我們帶來有效的
生物信息它是無用的而只有測到mRNA的序列，才是我們想要 的信息這樣，如何能夠選擇性地把mRNA 轉化成測序文庫並且避免把rRNA帶到測序文庫中來這就是單細胞mRNA測序當中，要解決的 第二個大難題接下來，我們就來介紹SMART方法和
TargetAmp方法，是分別如何解決上述 2個大難題的我們先來介紹Clontech公司推出的 SMART方法SMART方法的全稱是Switching Mechanism
at 5』 End of
RNA Template這張圖就是SMART方法的原理圖SMART方法最核心的技術，就是設計了 2個特殊的引物再配合用MMLV逆轉錄酶進行逆轉錄我們先來看這個逆轉錄的起始引物它哪，先是一段通用序列未來這個通用序列會用作PCR擴增的 引物識別序列中間是一長串的T，這些T是專門識別
mRNA的3』末端的Poly(A)尾巴序列它會和這些Poly(A)尾巴互補結合引物的最末端有一個定位的結構這個定位的結構，就是在它的3』末端 的倒數第2個鹼基是一個非T的簡併鹼基圖中用V來表示這個鹼基V鹼基就是或A、或C、或G，但是非T的 這樣一個（簡併）鹼基最後1個鹼基則是簡併鹼基N也就是A/C/G/T都有可能引物的這個末端結構，就是讓 它正好結合在mRNA的3』端連到Poly(A)
尾巴的這個連接處而不會結合到mRNA的別的地方這樣就保證了逆轉錄的起始位置正好 是mRNA的3』端的序列終止位置我們再來看這個MMLV逆轉錄酶這個酶有個特點，就是它在轉錄到mRNA 的5』端末端的時侯會在新合成的cDNA的3』末端，多加出 幾個C鹼基來再接下來，這個上游引物會發揮它的
作用這個上游引物，它有一個特點它的3』端是3個非脫氧的G鹼基也就是核糖核酸的、RNA的G鹼基而不是DNA的G鹼基這個引物可以與剛才新合成的cDNA的 3』端的那幾個C鹼基發生互補雜交然後引導這個MMLV酶再次發揮聚合作用以剛才那條新合成的cDNA為模板複製的結果，就是得到雙鏈的cDNA這個雙鏈cDNA，兩端都已經接好了我們 人工設計的PCR引物序列然後，就加入常規的PCR引物，進行 常規的PCR擴增常規PCR擴增，得到大量DNA然後可以象常規的DNA建庫那樣，超聲
打斷、建庫、上機測序了我們回顧一下這個過程，可以看到這個 方法的3個巧妙點第1點，是先用一個定位引物，保證 cDNA的合成是從mRNA的3』最末端開始的同時讓合成出的cDNA在下游連上了 一個通用PCR序列第2點，是利用MMLV逆轉錄酶會在新合成
的cDNA的3'端，多加上幾個C鹼基的特點再用有3個G鹼基的上游引物進行第二鏈 的合成這就保證只有完整的第一鏈cDNA也就是那些帶多個「C」的cDNA（第一鏈） 才能被合成出cDNA的第二鏈這也就保證了雙鏈cDNA是全長的cDNA第3點，就是要保證PCR擴增的效率的 一致性那我們知道，PCR擴增效率的最主要
的影響因素是引物的序列現在因為cDNA的5』端和3』端的都分別 引入了統一的引物序列所以，這就去除了因為引物序列的不同而引起PCR效率不同的，這個最主要的 偏差因素這也就在較大程度上保證了PCR擴增 效率的一致性，減少了PCR偏差經過實驗發現用SMART方法，對於1個細胞，也就是
10pg總RNA的RNA進行建庫測序RPKM為10的這些基因，有60%是被測序 測到的對RPKM為100的基因，有90%可以被測序 測到而且被測到的幾率，波動很小這說明SMART方法是一個有效的 單細胞mRNA測序方法如果您想第一時間收看到每一期的
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合成這個引物，在5』端有設計了一個T7 啟動子序列3』端是多個的T鹼基這一串T鹼基可與mRNA的poly(A)尾巴 相結合作為逆轉錄的起始引物經過逆轉錄，得到第一鏈的cDNA同時這條cDNA鏈上，被引入了一個 T7啟動子然後用RNase
H酶把cDNA:RNA雙鏈產物 中的這個RNA鏈消化掉接着再合成出第二條cDNA鏈來這個雙鏈的cDNA就可以作為轉錄的模板利用鏈上的T7啟動子轉錄出大量的反義RNA來 （antisense-RNA，aRNA）接着，將這些反義RNA進行純化再用隨機引物進行逆轉錄，得到第二輪 的cDNA接着，再用T7-Oligo(dT)這個引物粘到第二輪的cDNA的Poly(A)尾巴上再合成出雙鏈DNA來這個雙鏈的cDNA再經過第二輪的轉錄，
又得到第二輪的反義RNA這些第二輪的反義RNA的量，足可以 達到微克級再經過一輪逆轉錄，就可以得到幾個 微克的cDNA那麼幾個微克的cDNA，就足以進行 建庫、測序之用了我們來看TargetAmp方法的巧妙之處它不是用PCR來擴增核酸而是用轉錄的方法來增加核酸的量因為擴增那麼多（倍）的核酸如果用PCR，要用幾十個循環那麼PCR不同的擴增子的擴增效率，
即使一開始是很小的差異也會在幾十個循環中，被指數放大變成一個很大的差異那麼TargetAmp方法用轉錄的辦法，而且 統一都用T7這個統一的啟動子它轉錄的啟始效率，大體上就保持了 一致它的每一輪轉錄，都把核酸的量擴大 幾千倍經過這樣兩輪的擴增，就把核酸的量
擴大了幾百萬倍這樣，一方面它得到了高達幾微克的 核酸足夠用於建庫同時又避免了PCR過程，也就避免了 PCR擴增偏差單細胞mRNA測序方法在循環腫瘤細胞研究、胚胎髮育研究、 和神經活動研究方面，有着廣泛的應用隨着高通量測序的費用不斷地降低它正變成科研中越來越普及的研究手段相信有更多單細胞mRNA建庫方法，和
更新的技術應用會不斷地被開發出來以上是本期的全部內容謝謝您的收看。我們下期節目再見
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